克隆技术在猪方面的研究

借助体细胞移植技术，己成功地获得了克隆羊、克隆牛和克隆山羊;而在有关克隆猪的专题报告中亦采用该方法，即将未分化的早期胚胎细胞(4细胞的卵母细胞胚)作为供核细胞 与去核卵母细胞融合。经表型选择后进行的猪克隆繁殖，在内品生产中具有潜在的重要意义。另外，基因修饰技术与克隆技术的结合能为人类创建外源性移植器官的潜在供体。 

　　从分化细胞迈向猪克隆的第一个步骤，就是要对各种可能影响猪体外胚胎发育的因素进行调查研究。从长白种母猪体采集的成熟卵母细胞，经2种电激活方法的任何一种刺激后，促使胚胎以单性生殖方式发育;然后将此胚胎置于微纤丝抑制剂(细胞分裂抑制素B)中，以避免因细胞的分裂而造成染色体的丢失，最后将这些胚胎放大3种不同培养基的任何一种内进行孵化(其它环境条件保持不变)。在一定强度的电激下，经多次脉冲刺激的胚胎其发育数少于采用单次脉冲电激的胚胎;另外，培养基的种类也影响了胚胎的发育，胚胎在 NCSU23培养基中发育情况最佳。随后，用单一的1.5kv/cmlOOμs脉冲电流刺激NCSU23培养基中的胚胎，在这些条件下测定体外成熟卵母细胞的发育潜力(以体内成熟卵母细胞作对照)。在采用这种电激方式的167个体外成熟的卵母细胞中，有116个在48h内分裂，但是仅4 个发育至胚泡，该比例显著地低于相应的体内成熟卵母细胞的发育率(p=0.001，X2=检验)。因此，在以后的试验中采用在体内发育的成熟卵母细胞。 

　　在众多有关家畜克隆的报道中均以胎儿成纤维细胞作为供核细胞，究其原因是这些细胞能在克隆前进行基因修饰。 因此，我们对猪胎儿成纤维细胞在核移植后继续发育的能力进行了评估。将“梅山×梅山( 黑毛)”猪在妊娠24d时屠杀取其胎儿，经胰蛋白酶作用后建立原代细胞培养。再将细胞进行高密度平板培养传代2至6次，最后进行融合；在不补充培养基的情况下连续培养l6d，产生的细胞处在G０期，最后用PCR方法鉴定每个胚胎的性别。由于与它们的成纤维细胞抗原性一致，经培养的细胞对细胞角蛋白和阶段特异性Ⅰ型胚胎抗原呈阴性反应，但是对中胚层的标记波形蛋白呈强阳性。 

　　由成年体细胞克隆的小鼠系采用特殊的非融合方法，即通过电压驱动微注射方法选择性地将供体核导入去核卵母细胞，我们将该方法应用于猪的细胞核移植中。在含有细胞松弛素的NCSU23培养基中，采用电压驱动微注射方法将取自长白小母猪或黑白花小母猪(长白×杜洛克)卵母细胞中的中期Ⅱ型染色体和第一极体除去，通过电压驱动微注射将“梅山×梅山(黑毛)”杂交猪的胎儿成纤维细胞核单个导入每个去核卵母细胞。重新生成的胚前体在38℃孵化3～4h，然后用脉冲电激活，最后再对所获得的核移植胚胎进行培养。 

　　虽然猪胚胎能在体外很好地发育至胚泡阶段，但移植到代孕母猪的子宫角后，生长发育情况却很差。由于要确保母猪能正常妊娠一般至少需要4个胎儿，据此推断如果子宫内存在经受精产生的辅助胚胎，会有助于克隆胚胎的完全发育。 

　　为了研究辅助胚胎在子宫内促进克隆胚胎发育的能力，设计了2个试验，克隆胚胎在试验Ⅰ中经体外培养20h(单细胞 胚胎)或在试验Ⅱ中经体外培养40h(2-4细胞的胚胎)后，移植到代孕母猪子宫中，所有分娩的后裔仔猪(试验Ⅰ的9只仔猪和系列试验Ⅱ的24只仔猪)全为白色，因此，可以证明这些仔猪为非克隆猪。克隆胚胎无法完成4胎的妊娠全过程的事实表明，核移植胚胎和辅助胚胎间的比例是相当重要的，本次试验中2种胚胎比例显然不是处在最佳程度。 

　　试验Ⅲ将在2-8细胞阶段间进行核移植的11O个克隆胚胎经成纤维细胞培养基传代2至6代后，移植到4只 不含辅助授精胚胎的代孕母猪子宫中,其中3只代孕母猪分别在胚胎移植后的27d、35d和6ld 开始发情，猪的发情周期为2ld，发情延迟表明每只代孕母猪已经妊娠。由于猪胚胎在子宫壁着床发生于胚胎发育的13d至l4d，所以很可能其中2只妊娠母猪在胎盘形成后就终止胚胎发育，胚胎终止发育的原因不明。 

　　在第3个试验中，第4只代孕母猪在接受36个克隆胚 胎的输卵管移植后仍继续妊娠，而这些克隆胚胎是在成纤维细胞培养基中传代至第2代时被取出移植的。其中一个克隆胚胎发育到足月，于2000年7月2日自然分娩，所产仔猪取名Xena，初生体重1.2kg，胎盘重0.3kg，两者均处于非克隆仔猪的正常值范围内。仔猪胎盘经解剖观察表明正常，而有些克隆牛的胎盘畸形，采用核微注射技术的克隆小鼠，其胎盘始终比非克隆小鼠的大得多。　　 

　　Xena克隆猪体质健康、雌性、黑毛色，与“梅山×梅山 ”核供体母体的预测结果相符。为了确证这一结果，从与Xena克隆猪有关的3个相关体 (Xena、长白代孕母猪、培基的成纤维细胞中提取DNA，设23个标识组，进行特异性微卫星标记分析。这些分析是在另外的实验室里进行的，因而不带有任何主观色彩。分析结果证实Xena克隆猪的基因组与梅山猪供核威纤维细胞的基因组属同一种类，与长白代字母猪的基因组有明显的区别。　 

　　上述研究结果表明，采用微注射技术将体细胞核移植到去核卵母细胞能成功克隆出猪。虽然还没搞清全部机理，但推测部分原因是由于微型吸管 的电压激活时操作快速所致;此外，猪克隆的成败可能与供核细胞的胞质染色体污染敏感度有关，相对融合(细胞移植，而言，微注射方法更有利核移植的进行。与融合不同，微注射可选择性地去除大部分供核细胞的细胞质，因而相对而言胞质的含量在胚胎早期是稀薄的。 

　　为了诱发牛和羊的种系突变，曾采用了体外细胞的基因随机整合技术和基因靶技术，以后则采用与隆有关的技术；这些研究结果为人们展现了这样一种前景：即这些技术也可以应用于猪。由于猪胚胎干细胞不能进行培养，因此这种技术具有广阔的应用前景。也可以借助理想基因型的个体复帛技术在常规育种或转基因中加快猪染色体操作技术的应用。本研究结果连同最近报道的猪胞质内精液注射技术都表明微注技术可推动猪克隆技术的发展。

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